SG胜游

前言：抗体药物偶联物（Antibody-Drug Conjugate, ADC）是一种结合了单克隆抗体、连接子（linker）和细胞毒性药物的复合物。与传统化疗药物相比，ADCs通过特异性靶向肿瘤细胞，旨在减少对正常细胞的损害，从而降低全身性毒性，提供更大的治疗范围和更高的治疗效益。近十年来，ADCs在实体瘤和血液肿瘤治疗领域取得了显著进展，成为肿瘤治疗研究中的一个创新领域。

尽管ADCs的发展取得了重要成就，但它们在临床应用中仍面临一些挑战，尤其是针对实体瘤的治疗。这些挑战包括：（1）实体瘤的复杂性限制了单一靶点的治疗效果；（2）治疗引起的压力可能导致抗原表达下调、表位变异或旁路途径的激活，从而增加ADC的耐药性；（3）正常组织中靶抗原的表达、连接子的不稳定性以及其它因素可能引起非目标毒性；（4）靶抗原对内化过程的抵抗可能限制了治疗效果的实现。因此，对抗体、连接子和有效载荷的进一步优化，是未来ADCs发展的关键。

面对临床挑战，一种创新策略是将双特异性抗体（Bispecific Antibodies, BsAbs）与连接子-药物复合物相结合，形成双特异性抗体药物偶联物（Bispecific Antibody-Drug Conjugates, BsADCs）。与传统的ADCs相比，BsADCs具备独特的双重表位/靶点结合能力，这不仅增强了对实体瘤中共同表达抗原的选择性，还显著提升了内化效率。这些优势使得BsADCs成为下一代ADC研究领域的一股强劲力量。目前，已有超过10种BsADCs正在进行临床试验阶段。BsADCs的设计超越了简单的“1+1=2”模式，其结合模式的创新对整体疗效产生了深远影响，这涉及到BsAbs、连接子和有效载荷的全面协调与优化。

BsADC的设计

目前，BsADCs的研究焦点主要集中在HER2、EGFR和c-MET等靶点上。在ADC的构成中，抗体、连接子和有效载荷每个部分都需要经过精心的独立优化。对这些关键组成部分的任何微小调整，都可能对药物的临床特性产生显著的影响。因此，在设计新一代的BsADCs时，应该将抗体、连接子-药物复合物的优化和偶联技术视为一个相互关联的系统，这要求采用一种全局性的策略来进行综合考虑。

●双特异性抗体
在构建BsADCs时，首要的考虑因素是精心挑选合适的靶点组合。正确的靶点选择是确保ADC成功开发的基础，它对药物的治疗窗口和可能的全身性毒性具有决定性的影响。面对传统ADC所面临的脱靶毒性和临床耐药性问题，以下准则有助于指导靶点的选择：

1.理想的靶点应具备良好的内化能力，在正常组织中的表达水平较低，而在肿瘤组织中表达水平较高。
2.考虑到实体瘤的异质性，需要评估靶点在不同肿瘤亚型和部位的表达情况，以实现更为精准的药物递送策略，避免依赖单一的解决方案。
3.对于BsADCs的双重靶向特性，必须全面评估抗原组合的深层效应，包括内化机制、再循环过程、周转速率、溶酶体降解能力以及固有的生物学机制等。这些因素的综合考量对于BsADCs的有效设计至关重要。

在探讨BsADCs的分类时，Fc区的存在与否是一个关键的区分标准。不包含Fc区的BsADCs在设计上可能会遇到稳定性不足、容易聚集以及缺乏有效的偶联位点等问题。而含有Fc区的BsADCs则能够带来一系列额外的好处，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）、补体依赖性细胞毒性（CDC）、免疫吞噬作用以及细胞因子的释放，这些都有助于增强对肿瘤的杀伤能力。以下是构建含有Fc区的BsADCs的策略：

1.Fc工程化修饰：通过对Fc区域的氨基酸序列进行突变或糖基化修饰，可以优化Fc与Fcγ受体的结合特性，从而减少可能引起的脱靶毒性。
2.保留ADCC和CDC作用：BsADCs的双靶点结合模式有利于形成六聚体结构，这可以增强ADCC和CDC的效果，进一步提升对肿瘤的杀伤效率。
3.保留FcRn结合能力或应用抗体工程：通过保留Fc区域与新生儿Fc受体（FcRn）的结合能力或采用抗体工程技术，可以提高BsADCs在体内的半衰期，从而增强其疗效和安全性。

连接子

在BsADCs中，连接子扮演着至关重要的角色，它是抗体与细胞毒性有效载荷之间的桥梁。理想的连接子应在血液循环中保持稳定，同时在肿瘤微环境中促进有效载荷的释放。目前，ADC领域中的连接子主要分为可裂解型和不可裂解型两种。

不可裂解型连接子在血浆中展现出极高的稳定性，仅在溶酶体环境中被降解，从而释放有效载荷。这种连接子有助于降低非目标组织的毒性、延长药物在血浆中的半衰期，从而提高安全性。然而，它们可能面临由于内化和溶酶体处理障碍导致的耐药性问题。因此，基于不可裂解连接子的BsADCs需要进一步优化，以增强内化效率以及后续的内体转运和溶酶体降解过程。

相较之下，可裂解型连接子因其广泛的适用性而受到青睐。可裂解型连接子的主要挑战在于控制有效载荷的非特异性释放，以避免引起脱靶毒性。某些特定的可裂解连接子，例如Val-Cit连接子，已被证明能够在早期和晚期内体中有效促进有效载荷的释放。此外，近年来提出的非内化ADC概念，通过化学或酶促切割在细胞外触发，可以针对肿瘤微环境（TME）及血管系统中的抗原，激活旁观者效应，从而增强杀伤效果。

有效载荷

细胞毒性有效载荷的选择对整体的抗肿瘤效果及可能的不良反应具有决定性影响。理想的ADC有效载荷应在低浓度下即显示出强大的药效，同时具备良好的血浆稳定性、低免疫原性以及适当的水溶性。此外，有效载荷还应具备与抗体结合的可用化学基团。

在BsADCs中，有效载荷的旁观者杀伤效应是一个关键的讨论点。这种效应指的是释放后的有效载荷能够杀死邻近的非靶向细胞。对于药物的药代动力学/药效学（PK/PD）特性而言，这是一种双刃剑。虽然旁观者杀伤效应可以提高ADC在肿瘤异质性环境中的疗效，但也可能增加对周围正常组织的脱靶毒性风险。这种效应通常与可裂解的连接子和疏水性有效载荷相关。如果BsADCs中的一个靶抗原在正常组织中表达，应避免使用具有旁观者效应的有效载荷，以减少潜在的脱靶效应。

新型药物有效载荷的开发对BsADCs的进步至关重要。新兴的有效载荷，如蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）、诱导铁死亡的药物、以及寡核苷酸等，为BsADCs的药物选择提供了更广泛的范围。这些新药的开发有望显著扩展BsADCs领域的药物种类，为治疗提供更多的选择性。

靶向HER2的BsADC

ZW49

ZW49是一种基于Zanidatamab的双特异性抗体药物偶联物，它利用链间二硫键半胱氨酸和蛋白酶可裂解的连接子，与N-酰基磺酰胺auristatin进行偶联，展现出良好的耐受性。这种设计通过其双特异性抗体的特性，促进了更有效的内化，同时其Fc区能够激发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）和补体依赖性细胞毒性（CDC）效应。这一设计满足了HER2表达患者的多个未被满足的临床需求。

临床前研究显示，ZW49在不降低对HER2的亲和力的同时，展现出了显著的肿瘤杀伤效果和良好的耐受性。目前，ZW49正在进行第一阶段的临床试验。截至2022年9月，公布的临床试验结果表明，在HER2表达的晚期实体瘤患者中，ZW49的客观响应率（ORR）达到了31%。然而，其眼部毒性问题（如角膜炎，发生率为42%）也不容忽视，需要在进一步的研究中予以关注和解决。

MEDI4276

MEDI4276是一种创新的四价HER2靶向ADC，通过将曲妥珠单抗的单链可变片段（scFv）与另一种针对HER2的IgG1抗体39S的N端融合而成。在针对难治性HER2阳性癌症的小鼠异种移植模型中，MEDI4276展现出了显著的抗肿瘤活性。然而，在临床试验阶段，MEDI4276并未达到预期的疗效与安全性的平衡。

在乳腺癌患者群体中，MEDI4276的总体客观响应率（ORR）相对较低，仅为9.4%。此外，确定的最大耐受剂量（MTD）为0.75 mg/kg，每3周给药一次。与ZW49相比，MEDI4276的较低MTD可能与其价态、有效载荷的选择以及抗体的配置有关，这些因素可能影响了其在临床试验中的表现。这些发现提示了对MEDI4276的进一步优化的必要性，以提高其疗效并改善其安全性特征。

靶向HER2*CD63的BsADC

CD63是一种四次跨膜蛋白，属于超家族成员，其表达广泛但不是普遍存在的。它主要在细胞表面、晚期内体和溶酶体中发挥作用。由于CD63在这些细胞区室中的分布，它被认为是双特异性抗体药物偶联物（BsADCs）的一个有前景的靶点，有助于增强内化作用和溶酶体转运，从而可能改善药物的传递效率和治疗成果。

通过将一个对CD63具有较低亲和力的突变臂与来自HER2抗体的另一个Fab臂结合，开发了一种靶向HER2和CD63的BsAb。这种设计利用了抗体依赖的受体交联机制，以增强HER2的内化效率，并促进与溶酶体的共定位。随后，这种Her2和CD63的双特异性抗体通过VC连接子与抗有丝分裂的有效载荷duostatin-3进行偶联。尽管如此，在低HER2表达的肿瘤中，该BsADC的疗效并不理想，这表明需要进一步的优化工作，可能包括提高DAR和解决肿瘤的异质性问题。

靶向HER2*PRLR的BsADC

催乳素受体（Prolactin Receptor, PRLR）在恶性乳腺上皮细胞中过表达，其通过自身的泛素化作用以及促进AP2复合物的招募，有效促进了网格蛋白介导的初始内化过程及随后的溶酶体转运。

采用"Knobs-into-Holes"（KIH）技术，设计了一种含有HER2特异臂和PRLR特异臂的双特异性抗体（Bispecific Antibody, BsAb）。这种BsADC通过在其表面赖氨酸上引入不可裂解的连接子（如N-succinimidyl 4-(maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate, SMCC），将DM1（一种抗有丝分裂药物）与抗体连接起来，形成平均药物抗体比率（DAR）为3.324的BsADC。研究表明，即使PRLR在细胞表面的表达水平低于HER2，也足以引发持续的内化作用和随后的溶酶体降解过程。这表明高周转率的表面靶标，即便表达水平不高，也能有效地促进内化和溶酶体降解，从而可能提高BsADCs的疗效。

靶向HER2*APLP2的BsADC

APLP2的细胞内尾部包含重叠的基于酪氨酸的NPXY和YXXæ基序。在网格蛋白介导的内吞作用后，APLP2可以与AP-2结合，介导有效的内化并直接导致溶酶体降解。

靶向EGFR的BsADC

EGFR是ERBB受体酪氨酸激酶家族的一员，在调节上皮恶性肿瘤的基本功能方面发挥着关键作用，然而，由于治疗压力诱导的获得性基因组改变，靶向EGFR单抗和TKI往往导致临床耐药性的出现。BsADCs有望解决抗EGFR耐药性机制，包括致敏突变和旁路通路的激活。

靶向EGFR双表位的BsADC

针对EGFR的耐药性问题，研究人员设计了一种新颖的双特异性抗体，该抗体通过融合针对EGFR上两个非重叠表位（9G8和7D12）的纳米抗体来实现。7D12纳米抗体的作用机制在于阻断EGFR的信号传导链，而9G8纳米抗体则稳定了EGFR的胞外区（ECD）的结合构象，从空间结构上阻止了受体的二聚化过程。这种设计不仅针对不同的EGFR突变细胞系展现出了显著的效力，而且在诱导表达野生型EGFR或对西妥昔单抗（Cetuximab）产生耐药性的NIH-3T3细胞的补体依赖性细胞毒性（CDC）效应方面更为有效。

这种双特异性抗体的开发策略，通过同时靶向EGFR的两个不同区域，可能为克服EGFR靶向治疗中的耐药性问题提供了一种新的解决方案。通过这种策略，可以更全面地阻断EGFR的激活和信号传导，从而提高治疗效果并减少耐药性的发展。

靶向EGFR和其它抗原的BsADCs

BL-B01D1是中国首个进入I期临床试验的双特异性抗体药物偶联物（BsADC），它同时靶向EGFR和HER3。该药物采用了公司独有的Ac连接子，与Mc连接子相比，Ac连接子具有更佳的稳定性和亲水性，减少了聚集的可能性。BL-B01D1的有效载荷是公司研发的喜树碱类似物ED04。在I期临床试验中，BL-B01D1显示出良好的安全性，没有报告与药物相关的患者死亡。在安全性评估中，10例可评估的非小细胞肺癌（NSCLC）末线患者中，客观响应率（ORR）达到了60%，疾病控制率（DCR）为90%。

目前，已有多种靶向c-MET和EGFR的双特异性抗体（BsAb）被报道，它们在抑制肿瘤增殖和转移方面显示出协同效应。在BsADC的设计中，精心选择表位组合对于避免对c-MET的过度或部分激活至关重要。AZD9592是针对EGFR/c-Met的ADC，它通过可裂解的连接子偶联了一种新型的拓扑异构酶1抑制剂，主要目的是解决对奥希替尼（Osimertinib）的耐药问题。与EGFR相比，AZD9592对c-MET具有更高的亲和力，旨在减少由EGFR介导的正常组织毒性。在患者来源的异种移植（PDX）模型和耐药模型中，无论是单独使用还是与奥希替尼联合使用，AZD9592都显示出了良好的抗肿瘤活性。

1231是针对MUC1/EGFR双特异性抗体药物偶联物，采用了非天然氨基酸定点偶联技术，通过可裂解的VC连接子偶联了hemiasterlin衍生物（一种微管抑制剂），其药物抗体比（DAR）为4。临床前研究表明，在食管鳞状细胞癌（ESCC）和非小细胞肺癌（NSCLC）患者衍生的异种移植模型中，1231展现出了强大的抗肿瘤效果。

靶向MET的BsADC

肝细胞生长因子（HGF）与间充质上皮转化因子（MET）信号通路在多种癌症的发展过程中起着关键作用，从癌症起始到转移的各个阶段均有其参与。MET的过度表达和基因扩增是EGFR靶向治疗中肿瘤逃逸的主要机制之一。C-MET能够与EGFR发生相互作用，导致对EGFR靶向治疗的耐药性，因此，抑制C-MET活性成为了克服EGFR耐药性的有效策略。

与传统的MET靶向抗体药物偶联物（ADC）相比，双表位MET×MET-BsADC的设计提供了一种创新的解决方案来应对现有挑战。这种双抗原抗体能够形成2:2的抗原-抗体复合物，从而促进MET的有效内化和溶酶体转运。REGN5093-M114通过蛋白酶可裂解的连接子将Maytansinoid类有效载荷M114与靶向MET的双特异性抗体（BsAb）的表面赖氨酸偶联，产生了平均药物抗体比（DAR）为3.12的BsADC。

临床前研究数据显示，REGN5093-M114能够显著抑制MET过表达的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞的增殖。目前，一项I期、剂量递增和剂量扩展的临床研究已经启动，旨在评估REGN5093-M114在成年MET过表达晚期癌症患者中的安全性和有效性（NCT04982224）。

新型ADC

BsADCs极大地拓宽了潜在靶点和支架的应用范围，超越了传统的治疗方法。实际上，BsADCs为非内化性抗原向内化性抗原的转变提供了一种高效的策略。例如，结合了快速内化的EphA2和非内化或内化缓慢的活化白细胞粘附分子（ALCAM）的BsAb。值得注意的是，当细胞表面的EphA2与ALCAM的比例超过特定的阈值0.2时，BsAb能够实现有效的内化；而当比例低于此阈值时，内化过程会受到限制。

MC-VC-pab-MMAF这一有效载荷复合物通过半胱氨酸残基的位点特异性偶联技术实现。在BsADCs的双重特异性结合作用下，内化效果可能会因同时靶向的相邻抗原而显著变化，这与它们的表达比例密切相关。这种特性扩展了抗原选择的广度，使得原本内化能力较弱的BsADCs设计成为可能。这种创新的方法为增强某些抗原的内化能力提供了一种精细的策略，增强了BsADCs对更广泛肿瘤抗原的多功能性和有效性。

技术的创新为BsADCs的制备带来了革命性的变化，并展现出显著的优势。特别是PEG化的BsADC（P-BsADC）的发展，它不仅确保了偶联的一致性，而且由于其较小的分子尺寸和缺乏Fc片段，展现出更高的内吞效率、组织渗透能力以及较低的毒性。

此外，配体诱导的瞬时抗体结构域结合技术（LITE）是一项前沿技术，它结合了生物药物的长半衰期优势和小分子药物的精确时间控制活性。这些创新策略在提高治疗效果的同时，最大限度地减少了非目标效应，预示着BsADC技术发展迈出了重要的一步。

BsADC面临的挑战

BsADC代表了一种融合ADC和BsAbs优势的新型治疗类别。然而，其面临的挑战依然存在，主要归因于实体瘤的复杂性，包括异质性、组织学障碍和渗透性差等。必须完善BsADC的设计策略以克服这些挑战。

拓宽抗体骨架

目前BsADCs的靶点选择相对有限，主要集中于HER2、c-MET和EGFR等几个热点。通过扩展双特异性策略，SG胜游可以将靶点范围扩展到那些内化能力不强或表达水平较低的靶点。利用BsAbs的多样性，可以增加BsADCs的抗原选择范围，实现抗肿瘤机制的多样化。例如，可以考虑基于T细胞参与或PD-L1靶向的免疫调节BsADCs。

清除不均匀的偶联

BsADCs的构建过程中，通过随机化学耦合的方式引入有效载荷可能会导致异质偶联，这种异质性可能会干扰双特异性结合模式，并影响BsADCs的物理化学特性和药代动力学（PK）特性。采用位点特异性结合策略，可以生成具有均匀药物抗体比（DAR）的BsADCs，提高药物递送的精确度和治疗反应的一致性。

明确两个靶标之间的参数

BsADCs的多价结合模式要求对两个目标之间的设计参数进行细致考量，这包括亲和力的大小、表达水平和价态的变化。双特异性结合模式通过价态和交叉臂结合影响整体的内化效率。因此，需要全面筛选不同亲和力的结合臂组合，以实现最佳的生物活性。

转运

BsADCs可以通过特定的转运模式，如利用低亲和力的转铁蛋白受体携带β-分泌酶抗体，促进有效穿越血脑屏障。已经发现靶向CD63、PRLR和APLP2的BsADCs具有辅助转运的能力，这为设计能够穿越生物屏障并逃避溶酶体降解的BsADCs提供了新的思路。

解决潜在的安全问题

尽管BsADCs旨在通过增强特异性来减少脱靶毒性和副作用，但早期临床数据表明，其临床安全性仍需进一步优化。除了抗体的创新之外，连接子-有效载荷复合物的研究同样关键，包括连接子的稳定性、同质偶联策略、DAR以及旁观者杀伤效应的考量。

小结：BsADCs的引入，以其独特的双重靶向机制，为抗体药物偶联物（ADC）的研究领域注入了新的活力，代表了新一代ADC疗法的兴起。尽管这一技术仍处于发展初期，但其展现出的潜力不容小觑。BsADCs在解决传统ADC在临床应用中遇到的难题以及推动精准靶向治疗药物的开发方面，扮演着关键角色。

除了BsADCs，一系列创新策略正逐步展现出其在新型ADC设计中的革命性潜力。这些策略包括但不限于：携带两种不同作用机制的有效载荷的ADC、能够调节肿瘤微环境免疫反应的免疫调节ADC、结合放射性同位素以实现直接肿瘤杀伤的放射性核素ADC、在肿瘤微环境中特异性激活的前体ADC、与其他治疗手段结合使用的ADC联合疗法，以及利用肽作为药物载体的肽-药物偶联物。这些策略的评估与应用，无论是单独还是组合使用，都为ADC领域的发展开辟了新的道路，预示着未来治疗的广阔可能性。